미토콘드리아 COI 유전자를 이용한 현생 폴립테루스의 계통분석 (한글판)

요약

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폴립테루스 속 (Lacèpede, 1803)은 가장 원시적인 형태의 조기어류의 일종으로, 한쌍의 진폐와 두꺼운 가노인 비늘을 갖고있는 어종입니다. 폴립테루스 속에는 현재까지 13종이 알려져 있으며, 전부 아프리카의 내수면에 서식합니다. 모든 폴립테루스 종은 현재 관상어로서 널리 유통되고 있으며, 일부 종들의 경우 동남아시아에서 관상용을 목적으로 양식되고 있습니다. 이러한 관상어로서의 높은 수요와 진화생물학상의 중요성에도 불구하고 분자생물학적 방식을 이용한 연구는 많이 이뤄지지 않고 있습니다.

본 연구에서는 유니버셜 프라이머를 이용해 폴립테루스의 미토콘드리아 시토크롬 C 산화조효소 서브유닛 1 (Mt-COI)의 PCR 기법 확인 및 일부 새로운 개체군을 포함해 유전적 관계도를 작성했습니다.

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1. 서론

폴립테루스란?

폴립테루스 속 (Lacèpede, 1803)은 진화생물학적으로 매우 중요한 원시적인 형태의 조기어류로, 아프리카의 하천에 서식한다. 폴립테루스는 육기강에 속하는 폐어 (Protopterus, Owen, 1839) 및 실러캔스 (Latimeria, Smith, 1939)와 여러 형태학적, 분자적 특징들을 공유한다. (Dai Suzuki et. al. 2010)

폴립테루스에 대한 대부분의 분류학적 연구들은 형태학적 차이에 따라 이뤄졌으며, 분자생물학적 방법을 채택한 연구는 2010년 교토대학교의 Dai suzuki 외에 의해 미토콘드리아 Cytochrome B 유전자와 16srRNA를 통해 이뤄진 연구만을 찾을 수 있었다. 그러나 미토콘드리아 시토크롬 C 산화조효소 서브유닛 1 (Mt-COI)를 이용한 결과는 찾을 수 없었다.

본 연구에서는 유니버셜 프라이머 (HCO2198r-LCO1490f)를 이용한 PCR 기법이 폴립테루스에 적용 가능한지를 확인하고, Britz & Moritz에 의해 2019년 제시된 폴립테루스 종들의 형태학적 특징들에 부합하지 않는 새로운 개체군들을 일부 포함하여 폴립테루스 종들간 유전적 관계를 분석하였다.

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2. 재료 및 방법

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Table 1 . Collection point of used specimens

Collection point	Country	Scientific name	Specimen code
Kourubal river	Guinea	Polypterus ansorgii Boulenger, 1910	A1 (1 specimen)
Niger river (Lagos)	Nigeria	Polypterus bichir Lacèpede, 1803	B1 (1 specimen)
Niger river (Lagos)	Nigeria	Polypterus sp. Nigeria	NSP1, NSP2, NSP3 (3 specimens)
Ogun river	Nigeria	Polypterus senegalus Cuvier, 1829	NS1, NS2, NS3, NS4 (4 specimens)
Congo river (Kinshasa)	D. R. Congo	Polypterus congicus Boulenger, 1898	C1 (1 specimen)
Black volta river	Ghana	Polypterus endlicheri Heckel, 1847	BE1 (1 specimen)
Lake Tanganyika (Kirando area)	Tanzania	Polypterus sp. aff. "congicus"	K1, K2, K3, K4, K5, K6 (6 specimens)
Lake Turkana	Kenya	Polypterus senegalus Cuvier, 1829	TS1, TS2, TS3 (3 specimens)

Table 2 . List of specimens and their code.

Immersion specimens (85% ethanol)	Polypterus congicus (C1), Polypterus senegalus (NS1,NS2,NS3,NS4,TS1, TS2, TS3), Polypterus sp. aff. "congicus" (K1, K2)
Frozen specimens	Polypterus ansorgii (A1), Polypterus bichir (B1), Polypterus sp. Nigeria (NSP1, NSP2, NSP3), Polypterus sp. aff. "congicus" (K3, K4, K5, K6), Polypterus endlicheri (BE1)

모든 표본은 관상어로서 현지의 채집업자들에 의해 채집, 수출된 개체들로 본 실험에 사용한 표본의 채집지와 코드는 Table 1.에서 찾아볼 수 있다. 모든 표본은 운송중 폐사하거나 사육 도중 폐사한 개체들로, 냉동 혹은 액침표본으로 보관되었으며, 액침표본은 85% 에탄올에 침지한 후 실온에서 보관되었다.

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Fig. 1. Map of Kirando area, South-East coast of Lake Tanganyika, Tanzania.

Table 3. Morphological characteristics between Polypterus congicus and Polyterus sp. aff. "congicus"

	Polypterus congicus	Polypterus sp. aff. "congicus"
Body pattern	reletively thin dorsolateral bar-pattern (1~2scale rows wide)	Reletively thick blotch-like patterns (3~6scale rows wide)
Ventrolateral marking	Only few	Very deep
Lateral head marking	Only few	Very deep
head and lip marking	Only few	Very deep
Radial dorsal head marking	Only some specimen has blear marking	Identical deep radial dorsal head marking

Polypterus sp. aff. "congicu" 표본은 탄자니아의 키란다 지역에 위치한 키란도 항과 만도 섬 사이에서 채집되었다. Polypterus sp. aff. "congicus"라는 명칭은 Frank shäffer가 그의 책에서 처음으로 제안한 명칭으로 전장 150~300mm 사이의 운송 도중 폐사한 개체들을 표본으로 사용하였다. 이는 Polypterus sp. aff. "congicus"에서는 처음으로 보고되는 작은 크기의 표본으로 이전까지 보고된 모든 표본은 전장 381~788mm였다. (Büscher, H. H. 2004)『Aqualog Polypterus Flösselhechte Bichirs』(2004) p.61-p.63. 

본 연구에서는 Polypterus congicus와 Polypterus sp. aff. "congicus" 간의 형태학적 차이 (Table 3.) 및 원형의 머리 무늬 등을 통해 서로 다른 개체군으로서 가정하고 실험을 진행하였다. Polypterus sp. aff. "congicus" 특유의 머리 무늬는 Frank shäfer에 의해 2004년 처음 확인되었으나, 콩고산 Polypterus congicus 개체들에서도 일부 발견된다. 

Fig. 2. Live coloration of Polypterus congicus from Congo river, Kinshasa, D. R. Congo

Fig. 3. Live coloration of Polypterus sp. aff. "congicus" from Kirando area, Lake Tanganyika, Tanzania

Fig. 4. Dorsal head marking of Polypterus sp. aff. "congicus" from Kirando area, lake Tanganyika, Tanzania (Photo credit: Hyemin Park / Healing aqua)

Fig. 5. Overview of principal color patterns in Polypterus presented by Moritz & Britz

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Table 4. Morphological characteristics between Polypterus endlicheri, Polypterus sp. Nigeria and Polypterus bichir

	Polypterus endlicheri	Polypterus sp. Nigeria	Polypterus bichir
Body pattern	Dorsalated bars	Dorsalated bars	Dorsal and leteral blotches
Body color	Yellow-brown or Red-brown	Greenish gray	Greenish gray ~ Brown
Longitudinal series scales	53~60	63	55~70
Dorsal spine	11~14	13	13~18

Polypterus endlicheri, Polypterus bichir, Polypterus sp. Nigeria간 형태적 차이는 Table 4. 에서 볼 수 있다. 측선 비늘수는 나이지리아 라고스에서 채집된 Polypterus endlicheri와 케냐 투루카나 호수에서 채집된 Polypterus bichir 표본에서 측정되었으며, Moritz & Britz (2019)의 연구 또한 참고하였다. 기니 다볼라 지역에서 채집된 Polypterus bichir 표본은 Polypterus sp. Nigeria와 유사한 회녹색에 가까운 체색을 갖는 것으로 보고된 바 있다.

이와 같이 Polypterus sp. Nigeria가 Polypterus endlicheri, Polypterus bichir와 형태학적으로 많은 특징들을 공유하고 있기 때문에 본 연구에서는 Polypterus sp. Nigeria를 Polypterus bichir와 Polypterus endlicheri의 자연교잡종 혹은 종이나 아종 단계의 새로운 개체군으로서의 가능성을 열어두고 연구를 진행하였다.

Fig. 6. Live coloration of Polypterus endlicheri from Lagos, Nigeria

Fig. 7. Live coloration Polypterus bichir from Dabola area, Guinea (Photo credit: Hyemin Park / Healing aqua)

Fig. 8. Live coloration of Polypterus sp. Nigeria used for this experiment (NSP3)

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Fig. 9. Representation of measurements presented bt Moritz & Britz

Table 5. Meristic characters of Polypterus senegalus from Ogun river, Nigeria and Lake Turkana, Kenya

	Ogun river (NS4)		Ogun river (NS1)	Lake Turkana (TS2)	Lake Turkana (TS3)
Dorsal-fin spines	9		9	10	9
Dorsal- and caudal-fin rays			4	5	5
Pectoral-fin rays	37		36	36	37
Pelvic-fin rays	11		11	11	11
Anal-fin rays	10		9	12	9
Scales in longitudinal series	59		58	61	61
Scales around body 3rd one predorsal	35		35	37	37
Pre-dorsal scales	18		17	17	17
Pre-pelvic scales		39	41	40	39

Table 6. Morphometric characters of Polypterus senegalus from Ogun river, Nigeria and Lake Turkana, Kenya on measurements

	Ogun river (NS4)	Ogun river (NS1)	Lake Turkana (TS2)	Lake Turkana (TS3)
TL (mm)	249	246	370	342
SL (mm)	228	220	332	303
pre DL (mm)	82	73	105	102
Sn PL (mm)	67	67	96	87
DFL (mm)	126	125	200	188
Dist PD (mm)	17	18	12	17
HL (mm)	37	38	53	44
SnL (mm)	7	7	10	9
EyD (mm)	5	6	6	5
PoL (mm)	25	24	37	31
prePL (mm)	36	35	52	49
preVL (mm)	145	143	220	194
preAL (mm)	193	183	292	253
BD (mm)	25	23	41	38
D1L (mm)	12	9	13	15
D2L (mm)	14	11	17	16
AFL (mm)	15	18	30	26
AFB (mm)	7	5	15	13
CPL (mm)	10	10	11	9
NOD (mm)	7	6	6	7
IOW (mm)	11	10	13	11
HW (mm)	22	22	33	28
D1W (mm)	2	3	5	4
GuL (mm)	25	25	37	32
PBW (mm)	8	8	11	10
IPW (mm)	15	15	23	19

Polypterus senegalus의 샘플은 Moritz & Britz (2019)에 의해 제시된 Fig. 9.의 측정기준에 따라 계측되었다. 표본은 나이지리아 오건강산 개체와 케냐 투루카나산 개체에서 각각 2개체씩 무작위로 선발하여 측정하였으며, 측정 결과는 Table. 5에서 확인할 수 있다. 4개체의 표본 전부 성적으로 성숙한 암컷 개체였으며, 모든 길이는 버니어 칼리퍼스를 이용해 지점에서 지점으로 측정되었다. Polypterus senegalus는 전장에 있어 300mm를 잘 넘지 않는 것으로 알려져 있으며 (Moritz & Britz 2019), 본 연구에 있어 사용된 나이지리아 오건강산 표본의 경우에도 각각 전장 228mm, 220mm이었다. 반면 케냐 투루카나 호수 원산의 표본은 훨씬 큰 전장 332mm, 303mm를 보여 큰 차이를 보였다.

케냐 투루카나 호수산 Polypterus senegalus와 나이지리아 오건강산 Polypterus senegalus간의 Meristic characters에 있어서는 별다른 차이를 보이지 않았으나, 일부 Morphometrical differences에서 차이를 확인할 수 있었다.(Table 7). 따라서 본 연구에서는 나이지리아 오건강산 Polypterus senegalus와 케냐 투루카나 호수산 Polypterus senegalus를 각기 다른 표현형으로 분류하여 실험에 임하였다.

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Table 7. Morphometrical differences on percentage between Polypterus senegalus from Ogun river, Nigeria and Polypterus senegalus from Lake Turkana, Kenya

	Polypterus senegalus Ogun river, Nigeria				Polypterus senegalus Lake Turkana, Kenya
	NS4 ​			NS1	TS2	TS3
SL	228mm			220mm	332mm	303mm
HL/HW	1.68		1.73		1.61		1.57
HL/NOD	5.29		6.33		8.83		6.29
SL/HL	6.16		5.79		6.26		6.89
SL/CPL	22.80		22.00		30.18		33.67
SL/NOD	32.57		36.67		55.33		43.29
SL/IOW	20.73		22.00		25.54		27.55
SL/BD	9.12		9.57		8.10		7.97
Sl/EyD	45.60		36.67		55.33		60.60

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PCR & Purification

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Purification과 PCR에는 꼬리지느러미 조직과 복강 내의 근육조직이 사용되었으며, 근육 조직은 가슴지느러미 사이에서 5cm가량 아래 지점을 절개하여 채취하였다. Purification은 Cosmogenetech 사의 Plasmid DNA Purification Kit Mini 제품에 제공된 사용설명을 따라 이뤄졌으며, PCR 조건은 Table 8에서 확인할 수 있다. 본 실험에 사용된 유니버셜 프라이머는 LCO 1490f (5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3')와 HCO2198r (5'TAAACTTCAGGGTAGACCAAAAAATCA-3') (Folmer et al. 1994)이다. PCR 이후에는 DNA의 증폭 여부를 확인하기 위해 겔 전기영동을 시행하였다. 전기영동에 사용한 겔은 1x TAE buffer 200ml당 SeaKem LE Agarose 1g와 Metaphor Agarose 0.8g을 넣어 만들었으며, 혼합 후 전자렌지를 이용해 녹인 후, 5분간 냉각 후 5ul의 Red-safe를 첨가하여 완성하였다. 전기영동은 100v에서 20분간 Mupid®EX (Advance) 장비를 이용해 수행되었다. 전기영동 이후 UVtransilluminator (Daihan Scientific WUV-20)와 Gel image analyze system (DaihanScientific WGD-20)를 이용해 밴드를 확인하였으며, 밴드가 확인된 샘플은 Macrogen 사로 보내져 시퀀싱하였다.

본 실험을 통해 얻어진 COI 유전자 시퀀스는 DNAsp 프로그램을 이용해 Fasta 파일로 전환 후, MEGA 7 프로그램을 이용해 가공, Neighbor-joining 방식의 P-distance 모델로 계통도를 제작하였다.

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Table . PCR conditions.

	Temperature	Time	Cycles
First denaturation	95℃	3 mins	1 time
Denaturation	95℃	30 seconds	35 Cycles
Annealing	42℃	40 seconds
Elongation	72℃	1 min
Final extension	72℃	5 mins	1 time
Storage	4℃	Storage till next experiment

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3. 결과

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DNA purification & PCR

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본 실험을 통해 BE1, K1, K2, K3, K4, K5, K6, NSP3 표본의 시퀀스를 얻을 수 있었으며, A1, B1, C1, NS2, NS3, NSP1 표본은 더블 피크 현상을, NSP2, TS1 샘플의 경우 로우 피크 현상을, NS1, NS4, TS2, TS3 샘플은 증폭되지 않는 결과를 얻었다. 성공적으로 분석된 염기서열은 MEGA 7프로그램을 이용해 정지코돈과 공백을 제거하는 가공을 거친 뒤 629bp 길이로 가공되었다.

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Genetic relationship

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본 연구에서 얻어진 8개의 Mt-COI 시퀀스와 BOLDSYSTEMS에서 찾을 수 있는 109개의 폴립테루스 Mt-COI 시퀀스를 이용해 유전적 계통도를 제작하였다. 계통수는 MEGA 7 프로그램을 이용해 Neighbor-joining 방식의 P-distance 모델로 제작되었으며 (Fig. 10), 이번 연구에서 얻은 8개의 새로운 시퀀스와 기존의 "대형종 그룹"에 속하는 종간의 Genetic distance 표를 작성하였다. (Table 9).

Polypterus sp. aff. "congicus"의 경우 개체들간 0.84%의 유전적 차이를 보였으며, BOLDSYSTEM에 업로드되어있는 기존의 Polypterus congicus 시퀀스와는 0.89%의 차이를 보였다. 따라서 Polypterus sp. aff. "congicus"는 Polypterus congicus의 지역 변이로 보는 것이 타당할 것으로 보인다. 또한 Fig. 10의 결과는 Polypterus congicus가 Polypterus endlicheri의 아종이 아닌 별도의 종이라는 기존의 연구 결과를 지지하는 모습을 보였다. (Dai Suzuki et. al. 2010)

Polypterus sp. Nigeria는 Polypterus bichir 계통과 같은 그룹으로 확인되었으나, 여전히 2.7%의 차이를 보였다. (Polypterus bichir bichir와는 2.7%, Polypterus bichir lapradei와는 2.2%, 전체 Polypterus bichir 시퀀스와는 2.3%의 차이를 보였다.)

가나 블랙볼타 강에서 채집된 Polypterus endlicheri 시퀀스의 경우 BOLDSYSTEMS에서 확인 가능한 기존의 시퀀스들과 3.09%의 차이를 보였으며, 기존에 알려진 "대형종 그룹"의 폴립테루스 (Polypterus congicus, Polypterus endlicheri, Polypterus ansorgii, Polypterus bichir) (Suzuki et al. 2010; Near et al. 2014) 개체군에 있어 종내 변이는 평균 0.23%, 종간의 유전적 거리는 7.4%로 확인되었다.

Fig. 10. Evolutionary relationships of extant Polypterus species.

Table 9. Estimates of Evolutionary Divergence between new populations of Polypterus and other valid "Large" species group.

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4. 고찰​

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PCR & DNA Purification

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본 실험에 사용된 대부분의 표본들은 1년 이상 냉동 혹은 액침상태로 보관되던 것으로, 이 것이 낮은 Purification 성공률의 원인으로 생각된다. 또한 본 실험에 사용된 Purification 기법이 고치벌류와 같은 미소곤충에 주로 사용하는 방법인 점, 곤충 조직은 어류 근육조직과는 달리 지방질이 그리 많지 않다는 점 또한 낮은 Purification 성공률의 원인으로 추정된다. BE1 표본을 제외한 모든 성공적으로 분석된 표본들이 미성숙한 개체인 점 또한 체내에 존재하는 지방의 양에 의한 것으로 추측해볼 수 있을 것이다. 때문에 추가적인 연구를 위해서는 불필요한 지방질을 효과적으로 제거할 수 있는 새로운 Purification 방식을 확립할 필요가 있을 것이다.

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Genetic relationships

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Table 10. Genetic distance based on COI gene on percentage between Polypterus sp. Nigeria, Polypterus endlicheri "Black Volta" with other related valid species.

	Genetic distance based on COI gene on percentage
Polypterus sp. Nigeria (NSP3) - Polypterus bihcir bihcir	2.7%
Polypterus sp. Nigeria (NSP3) - Polypterus bichir lapradei	2.2%
Polypterus sp. Nigeria (NSP3) - Polypterus endlicheri	6.4%
Polypterus endlicheri "Black volta river" (BE1) - Polypterus endlicehri	3.09%

본 연구를 통해 블랙볼타산 Polypterus endlicheri (BE1)와 Polypterus sp. Nigeria (NSP3)이 기존의 모계통과 주목할만한 유전적 차이를 보이는 것으로 확인되었다 (Table 10.). 많은 어류들에서 2% 이상의 Mt-COI 염기서열 차이는 종 분화의 강력한 증거로서 생각될 수 있다고 알려져있다 (Karen Larissa Auzier Guimaraes et. al. 2022). 그러나 본 연구는 표본의 수가 너무 적고, 비교군 또한 BOLDSYSTEMS에 등록된 채집 지역 혹은 야생 채집 또는 양식 개체 여부를 알 수 없는 시퀀스들이 사용되었기에 더욱 많은 수의 정확한 채집지역을 확인할 수 있는 비교군 표본을 포함한 추가적인 연구가 필요할 것이다.

Polypterus sp. Nigeria의 경우 많은 수의 형태학적 특징들을 Polypterus endlicheri, Polypterus bichir와 공유하는 만큼, 세포핵 DNA 분석을 통하여 자연 교잡 여부 또한 확인해볼 필요가 있을 것이다. (Mt-COI의 경우 교잡여부를 확인하는 데에는 적합하지 않다) 또한 Polypterus sp. Nigeria의 경우 여러 형태적 특징들을 갖는 개체들이 보고된 만큼 다양한 표현형을 포함하는 더욱 많은 수의 표본들을 이용한 연구 또한 필요할 것으로 보인다.

Polypterus congicus의 경우 콩고강 및 탕가니카 호수 서부에서 채집된 더욱 많은 샘플과 Polypterus sp. aff. "congicus" 표본을 추가로 확보하여 연구를 진행한다면 더욱 정확한 결과를 얻을 수 있을 것이다.

마지막으로 BOLDSYSTEMS에 Polypterus sp. Koliba로 등록된 시퀀스의 경우 기존의 연구에서 Polypterus sp. Koliba를 Polypterus bichir "Koliba coloration"으로 보고한 기존의 연구 결과와는 달리 Polypterus endlicheri와 같은 그룹으로 표기되었는데, 본 시퀀스에 사용된 표본의 사진 및 형태학적 특징을 확인할 수 없기에 본 표본이 기존에 알려진 Polypterus sp. Koliba가 맞는지에 대한 진위여부를 의심해볼 필요가 있을 것으로 보인다.

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5. 감사인사​​

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본 연구는 학부 졸업논문으로서 군산대학교 해양생명과학과 한현섭 교수님의 지도 하에 작성되었습니다. 본 연구 및 논문 작성 전 과정에 많은 도움을 주신 한현섭 교수님, PCR 및 Purification 과정에 대한 지도 및 도움을 주신 군산대학교 생명과학과 김효중 교수님, 김상진 연구원님, 전기영동을 도와주신 군산대학교 수산생명의학과 김민수 학생, 표본을 제공해주신 힐링아쿠아의 박혜민 대표 및 본 연구에 있어 여러 아이디어 제공 및 현지 사진을 제공해주신 일본의 폐어 연구가 Komeiji Hiroki씨에게 감사를 드립니다.

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6. 참고문헌

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Timo Moritz & Ralf Britz. 2019. revision of the extant Polypteridae (Actinopterygii: Cladistia)

 

Dai Suzuki, Matthew C Brandley, Masayoshi Tokia. 2010. The mitochondrial phylogeny of an ancient lineage of ray-finned fishs (Polypteridae) with impolications for the evolution of body elogation, pelvic fin loss, and craniofacial morphology in Osteichthyes.

 

Büscher, H. H. 2004. Ein Urfisch im Tanganjikasee. DATZ, 57: 10-15.

 

Frank schäfer,『Aqualog Polypterus Flösselhechte Bichirs』, Aqualog (2004), p.61-p.63

 

Franz Steindachner. Polypterus Lapradei n. sp. und Polypterus senegalus Cuv. aus dem Senegal. 1869, Sitzungsberichte der Kaiserlichen Akademie der Wissenschaften. Mathematisch-Naturwissenschaftliche Classe vol.60 p.103-p.108

 

G.A.Boulenger. 1898. L.-On the species of Polypterus.

 

Karen Larissa Auzier Guimaraes et. al. 2022. DNA barcoding and phylogeography of the Hoplias malabaricus species complex.

 

Folmer et. al. 1994. DNA primers for amplification of mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I from diverse metazoan invertebrates. Mol Mar Biol Biotechnol 3:294–299